Tra gli elementi dell’eredità spirituale di San Francesco, la devozione a Santa Maria Vergine è presente nella Basilica. Francesco, sia nei suoi scritti che nelle agiografie, non si stanca mai di contemplare Maria per meglio contemplare il mistero di Gesù. Maria è Modello di virtù, Avvocata dell’Ordine, Tabernacolo, Vergine fatta Chiesa, Donna del Sì che ha reso Gesù nostro fratello e "ci ha ottenuto misericordia".

Ciò spiega la ricca iconografia mariana presente nella Basilica di San Francesco.
Maria Addolorata ci accompagna nel cammino penitenziale del ciclo del Maestro di San Francesco nella navata della chiesa inferiore e nelle varie scene della passione e delle crocifissioni presenti nelle due chiese.
Maria Madre di Dio è nel transetto nord della chiesa inferiore con la Maestà di Cimabue e il ciclo dei Vangeli dell’infanzia di Giotto e scuola, nonché nelle storie del Nuovo Testamento della parete sud della navata della chiesa superiore.
Alle storie della Vergine è dedicata l'abside della chiesa superiore, luogo deputato alle grandi celebrazioni eucaristiche, con un ciclo di Cimabue che evidenzia il suo ruolo fondamentale per poter giungere al Cristo.

Tra le tante raffigurazioni presenti, la Vergine tra San Francesco e San Giovanni Battista (1310-1319) di Pietro Lorenzetti, nella Cappella di San Giovanni del transetto sinistro della chiesa inferiore, mostra Maria che guarda con muta approvazione Francesco, mentre il Figlio è intento a giocare con il suo velo. L’affresco è posto sopra un'opera di rame a sbalzo del ‘900 raffigurante le Storie della Vergine che custodisce una preziosa reliquia donata nel ‘300 dal principe romano Tommaso degli Orsini come ex voto dopo la miracolosa guarigione da una grave infermità.

Secondo la tradizione, si tratta del velo della Vergine Maria che viene esposto solo due volte l’anno: l’8 dicembre e il 15 agosto.